基于网络药理学及分子对接技术研究疏风解毒胶囊治疗新型冠状病毒肺炎的潜在靶标及机制

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引用：沈浮,付中应,吴泳蓉,et al.基于网络药理学及分子对接技术研究疏风解毒胶囊治疗新型冠状病毒肺炎的潜在靶标及机制[J].中医药导报,2020,26(8-15).

2019年12月，在湖北省武汉市出现了新型冠状病毒感染的肺炎（简称新冠肺炎）[1]。2020年2月11日，世界卫生组织（WHO）将这种肺炎命名为COVID-19（coronavirus disease 2019），此次疫情构成国际关注的突发公共卫生事件[2]。此后，COVID-19确诊病例迅速增加。目前已经在全世界范围内流行，截至2020年3月5日，全国累计报告确诊新冠肺炎病例80,409例，累计死亡病例3012例，境外共76个国家确诊12,668例，死亡共计214例[3]。新冠肺炎感染初期多伴有发热、乏力、干咳等临床表现，重症患者可出现呼吸困难与低氧血症，甚至急性呼吸窘迫综合征等[4]。其具有传染性强、传播速度快等特点。

 对于COVID-19，目前尚未研发出特异性疫苗及抗病毒药物。中医将其归属为“疫病”范畴[5]，中医药对于疫病诊治积累了数千年的经验，并且COVID-19患者多为轻型，早期的中医药干预对于降低死亡率有着重要意义[6]。疏风解毒胶囊为国家卫生健康委发布的《新型冠状病毒感染的肺炎诊疗方案》试行第六版中推荐使用的中成药[7]。疏风解毒胶囊具有祛风清热、解毒散结的功效，由虎杖、连翘、板蓝根、柴胡、败酱草、马鞭草、芦根、甘草8味中药配伍组成，具有较好抗病毒作用[8-9]。方中虎杖能祛风、除湿、解表、攻诸肿毒，为君药。连翘具有升浮宣散之力，能透肌解表、清热祛风；板蓝根清热解毒，为近代抗病毒常用品，二药共为臣药。柴胡和解表里；败酱草清热、解毒、善除痈肿结热；马鞭草清热解毒、活血散瘀；芦根能清降肺胃、生津止渴，四药共为佐药。甘草养胃气助行药，并调和诸药，为使药。诸药配伍能直达上焦肺卫，祛风清热，解毒散结，切合病毒性上呼吸道感染风热证风热袭表，肺卫失宣，热毒结聚肺系之病机[10]。在前期实验研究中，疏风解毒胶囊对甲型H1N1型流感病毒、呼吸道合胞病毒、柯萨奇病毒B3型和单纯疱疹病毒1型等病毒均有抑制作用，还能通过调节机体免疫改善肺炎症状[11-13]。

由于疏风解毒胶囊所含成分复杂，作用靶点广泛，系统地阐明中药的各种成分及其在复杂疾病中的作用机制是非常困难的，生物信息学的迅速发展为这一问题提供了解决方案[14]。网络药理学能够使药物发现过程具有可预测性，并且能够实现对中药复方的系统研究，对从整体水平揭示其作用的潜在分子机制具有重要意义[15]。基于此，本文利用网络药理学方法搜集疏风解毒胶囊治疗COVID-19中潜在的有效物质及靶标，再利用基于几何匹配和能量匹配的“锁-钥原理”的分子对接技术，以研究蛋白质受体和药物小分子之间结合能力, 从而虚拟预测药物作用靶点并对治疗COVID-19靶点及分子机制进行研究。

1  材料及方法

1.1  数据库及软件工具  本研究所涉及的数据库有计算系统生物学实验室数据库和分析平台（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP，http://tcmspw.com/tcmsp.php)、GeneCards数据库（https://www.genecards.org/）、OMIM数据库（https://omim.org/）、String数据库（https://string-db.org/）、Uniprot（https://www.uniprot.org/）、PubChem（有机小分子生物活性数据库，http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）、Uniprot数据库（https://www.uniprot.org/）、Protein Data Bank（PDB，https://www.rcsb.org/）。数据分析软件工具有Cytoscape-3.7.0（CentiScape插件）、R语言3.6.2程序（bioconductor等数据包）、AutoDock-4.2（基于python语言）以及OpenBabel-2.4.1、Chimera-1.14、PyMOL等可视化软件。

1.2  疏风解毒胶囊有效活性成分筛选  检索TCMSP数据库，得到疏风解毒胶囊中所含中药虎杖、连翘、板蓝根、柴胡、败酱草、马鞭草、芦根、甘草的有效成分，由于疏风解毒胶囊为口服药物，故采用一种胃肠吸收、分布、代谢和排泄综合模型（ADME）筛选化合物，以化合物的类药性（drug-likeness，DL）≥0.18、口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%为条件[16]，筛选并得到有效活性成分及靶标。

1.3  COVID-19疾病靶标提取  基于GeneCards数据库，以“Novel Coronavirus Pneumonia”为关键词[17]进行检索，获取COVID-19的疾病靶点，由于获得的基因名称较为冗长不利于后期数据处理，故应用Uniprot数据库对疾病靶点进行基因symbol转换。然后将疏风解毒胶囊主要活性成分的靶点与COVID-19相关靶点使用R语言程序取交集并绘制韦恩图，提取交集靶基因。

1.4  “药物-活性成分-靶标”网络图构建  将药物与有效成分及交集靶基因相映射，构建“药物-活性成分-靶标”调控网络利用Cytoscape-3.7.0软件进行可视化。其中节点的类型代表药物成分、疾病和交集靶标，利用“CentiScape”插件计算有效成分的“degree”值，“degree”值越高提示发挥主要功能的概率越大[18]。

1.5  交集靶标的蛋白网络互作（PPI）构建  将得到的交集靶标提交至String数据库，物种仅限于“智人”，置信度为0.4，并剔除游离节点[19]。通过Cytoscape-3.7.0软件构建并可视化PPI交互网络。根据PPI中节点的平均“degree”值为最低标准筛选核心蛋白。

1.6  GO及KEGG富集分析  为深入了解疏风解毒胶囊治疗COVID-19的生物学过程及通路信息，利用R语言3.6.2程序基于bioconductor等数据包提取信息，得到交集靶标的基因本体论（GO）功能富集分析和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

1.7  分子对接  本研究基于AutoDock-4.2软件通过将已知三维结构的配体化合物分子置于受体蛋白的活性位点处，利用特定的构象搜索策略改变配体取向、位置以及构象，以寻找配体和受体的最佳结合状态[20]。选取PPI核心蛋白“degree”的值排名前3的蛋白质作为受体，在PDB数据库下载其蛋白结构，疏风解毒胶囊化合物中“degree”值最高的前3种化合物作为配体，在PubChem下载其三维结构。将蛋白导入OpenBabel-2.4.1软件中进行格式转换，除去晶体分子所有的水分子和小分子配体，并加极性氢，加载电荷，构建活性口袋，并利用AutoDock软件与有效活性成分进行分子对接，结合能小于0，说明配体与受体可以自发结合[21]。最后利用Chimera-1.14及PyMOL软件对结果进行分析及可视化。

2  结    果

2.1  疏风解毒胶囊有效成分及其靶点筛选结果  经筛选，疏风解毒胶囊共有207个有效活性成分纳入本次研究，其中败酱草13个、板蓝根39个、柴胡17个、虎杖10个、连翘23个、芦根1个、马鞭草12个、甘草92个，部分关键有效活性化合物见表1。对这些成分进行靶点预测，去重后提取到靶点基因299个。并且疏风解毒胶囊中不同的中药存在相同的化合物的情况，化合物分布情况如图1所示。

2.2  COVID-19疾病靶标提取结果  通过检索GeneCards数据库，得到COVID-19疾病相关靶标共251个，与疏风解毒胶囊活性成分预测靶标相映射，共得到交集靶标48个。（见图2） 
 

2.3  “药物-活性成分-靶标”网络图构建结果  将48个疏风解毒胶囊治疗COVID-19的交集靶基因分别与筛选后的疏风解毒胶囊药物活性成分（部分有效成分未匹配到对应靶点，此处未展示）进行映射，建立有效活性成分与靶基因对应关系，将结果导入Cytoscape-3.7.1软件中根据对应关系及属性建立“药物-活性成分-靶标”调控网络，如图3所示。并且使用“CentiScape”插件计算每个节点对应的“degree”值，其值越大代表该节点在网络中发挥的作用越重要。在有效成分节点组中，排名前5的化合物是槲皮素（quercetin、MOL000098）、木犀草素（luteolin、MOL000006）、山柰酚（kaempferol、MOL000422）、汉黄芩素（wogonin、MOL000173）、刺槐黄素（acacetin、MOL001689），对应的“degree”值分别为43、22、19、15、11，为网络的关键化合物。在靶标基因节点组中，排名前5的靶标是CALM1、NOS2、PTGS2、DPP4、PTGS1，对应的“degree”值分别为83、75、55、43、37，为网络中的关键靶标。在药物节点组中，按照“degree”值大小排序为甘草、板蓝根、连翘、马鞭草、柴胡、虎杖、芦根。

2.4  蛋白网络互作（PPI）及核心蛋白预测  将疏风解毒胶囊治疗COVID-19的交集靶标导入String软件中进行蛋白网络互作分析，将结果导入Cytoscape软件中进行PPI网络图可视化展示，如图4A所示。PPI网络中共有48个节点通过545条边发生相互作用，平均局部聚类系数为0.754。PPI浓缩P值<1.0E-16。节点的大小和颜色深浅依据“degree”值而设定，即节点越大和颜色越深对应的靶蛋白的“degree”值越大，一般认为其值大于所有节点“degree”均值，则为PPI网络的核心蛋白，其中超过均值的靶蛋白有10个（平均值为17.8），分别是IL-6、ALB、MAPK1、CCL2、IL-4、IL-1B、EGFR、FOS、IL-2、BCL2L1，表明其在网络中处于核心地位，如图4B所示。
 

2.5  基因功能与通路分析  利用R语言3.6.2程序基于bioconductor等数据包提取信息，设定阈值P＜0.05，GO富集分析包括1335条生物过程（biological process，BP）、34条细胞组分（cellular component，CC）以及86项分子功能（molecular unction，MF）3个分支，并获得18条KEGG相关通路。对排名前20的GO富集分析及KEGG相关通路进行可视化展示。
 

BP分析（图5A）可以看出，这些靶点主要涉及对脂多糖的反应、细胞对生物刺激的反应、细胞对脂多糖的反应、细胞对细菌来源分子的反应、凋亡信号通路的调控等生物过程。

CC分析（图5B）可以看出，靶点主要涉膜筏、膜微结构域、膜区、富纤维蛋白颗粒、腔泡腔等细胞组分。

MF分析（图5C）中可以看出，靶点主要涉及细胞因子受体结合、细胞因子活性、BH结构域结合、死亡域、磷酸酶结合等分子功能。

KEGG通路分析结果（图6）显示，将疏风解毒胶囊治疗COVID-19涉及病毒蛋白与细胞因子和细胞因子受体的相互作用抗病毒相关通路（Viral protein interaction with cytokine and cytokine receptor），基因显著富集在HIF-1信号通路、 NF-κB信号通路、内分泌抵抗通路、EGFR通路以及鞘脂信号等通路上。
 

2.6  分子对接结果  基于以上结果分析，槲皮素、木犀草素、山柰酚为疏风解毒胶囊“degree”值最高的3种化合物，即关键性有效活性成分，IL-6、ALB、MAPK1为PPI核心网络中“degree”值前3的靶蛋白，故选择两者分别作为分子对接的配体和受体。（见表2）

槲皮素与IL-6、ALB、MAPK1对接的结合能分别为-2.18、-3.16、-1.95。木犀草素与IL-6、ALB、MAPK1分子对接的结合能分别为-1.37、-4.29、-4.42。山柰酚与IL-6、ALB、MAPK1分子对接的结合能分别为-1.23、-3.78、-3.85。一般认为配体与受体结合的构象稳定时能量越低，发生作用的可能性越大。疏风解毒胶囊中关键化合物与核心蛋白的结合能均小于0，说明关键化合物与核心蛋白的结合构象能量低，结构稳定。部分分子对接情况如图7所示。

3  讨    论

从COVID-19疫情发生至今，中医药在此次防疫工作中的早期干预及综合治疗的整体调控作用体现出明显优势[12,22]。国家卫生健康委联合国家中医药管理局已经颁布了7版《关于新型冠状病毒感染的肺炎诊疗方案》，其中在试行第四版至第六版均推荐了使用中成药疏风解毒胶囊，疏风解毒胶囊具有控制炎症因子水平以及抑制病毒等效果[12,22]，其中环烯醚萜苷类、苯乙醇苷类等化合物为抑制炎症因子表达的物质基础，通过有效降低乳酸水平，增加肺组织氧分压，促进肺部炎症的吸收，缓解局部症状，在病毒性肺炎的治疗中起着积极作用[12,23-24]。

本研究通过网络药理学的方法得出疏风解毒胶囊的活性成分中槲皮素、木犀草素、山柰酚、汉黄芩素、刺槐黄素干预COVID-19的富集性较高，为该药物的关键成分。研究显示槲皮素具有抗甲型流感病毒（H1N1）、登革病毒2型（DV2）、柯萨奇B病毒（CVB3）以及呼吸道合胞病毒（RSV-A）的作用[25]。木犀草素是一种天然黄酮类化合物，存在于自然界多种植物当中，富含木犀草素的植物常被用作中药治疗疾病，具有多种药理作用。木犀草素结构中具有3-OH和5-OH，有较好的抗病毒活性，其对病毒整合酶和蛋白酶都有不同程度的抑制作用[26]。汉黄芩素，即黄芩黄素或黄芩苷元，是从黄芩根中提取的一种具有生物活性的黄酮类化合物；研究表明汉黄芩素具有抗炎、抗肿瘤、抗纤维化及抗HBV等作用[27]。

通过构建PPI网络图可知IL-6、ALB、MAPK1等排名前列，提示为关键性靶蛋白，它们大多与炎症因子相关，与COVID-19的炎症因子释放相吻合。在GO富集分析的过程中，主要涉及脂多糖的反应、细胞对生物刺激的反应等生物过程、细胞因子受体结合等分子功能以及膜区等细胞组分，提示疏风解毒胶囊干预COVID-19的生物学途径丰富且复杂。在KEGG通路分析中，涉及1条抗病毒相关通路，及NF-κB等多条通路上。说明疏风解毒胶囊主要活性成分的作用靶点分布在不同的代谢通路，多成分、多靶点相互调节是疏风解毒胶囊治疗COVID-19的可能机制。在前期的基础研究中，证实了疏风解毒胶囊可通过抑制丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）/核转录因子-κB（NF-κB）信号通路来抑制脂多糖（LPS）诱导的小鼠炎性反应；并且可通过影响小鼠免疫功能，改善流感病毒H1N1引起的小鼠肺炎症状，对病毒性感冒有较好的治疗效果[28]。这与本次GO及KEGG富集分析结果相吻合，而疏风解毒胶囊治疗COVID-19的生物学途径可能与之类似。

在分子对接的过程中，本研究选取置信度较高的有效成分化合物与PPI中核心靶蛋白进行对接，结合能均为负值，提示模型对接效果好且稳定性强，疏风解毒胶囊可能通过IL-6、ALB、MAPK1等靶蛋白干预COVID-19来改善临床症状，促进机体修复。根据文献报道，新型冠状病毒与SARS-CoV病毒感染的途径均通过其表达的S-蛋白与人体内ACE2的结合[29]，在另一项关于COVID-19的网络药理学研究提示，木犀草素和槲皮素与ACE2结合强度与利巴韦林及瑞德西韦亲和力相似[20-30]，而疏风解毒胶囊中核心化合物均含有此有效成分，木犀草素和槲皮素可能在抑制SARS-CoV病毒复制中发挥重要作用。

综上所述，本研究基于网络药理学及分子对接技术探讨疏风解毒胶囊治疗COVID-19的潜在药效成分及机制进行探索，以期为临床应用提供一定的依据。另外，基于网络拓扑参数分析确定的一些关键目标和通路需要在实验研究中得到验证，可以为今后的实验研究提供新的思路。

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（收稿日期：2020-03-04  编辑：蒋凯彪）